Проект EXCALIBUR исследует сложности производства биоудобрений и биопестицидов, анализируя преимущества двух производственных процессов и определяя области улучшения для облегчения расширения масштабов и широкого внедрения.
Полезные для растений микроорганизмы (как биоудобрения, так и агенты биоконтроля) все чаще признаются устойчивой альтернативой химическим удобрениям из-за их многочисленных преимуществ для сельского хозяйства, окружающей среды и здоровья человека.
Одно из наиболее цитируемых определений биоудобрений было описано Малусой и Василевым десять лет назад: Биоудобрение можно определить как продукт, содержащий один или несколько микроорганизмов, которые улучшают питательный статус (а также рост и урожайность) растений путем замены почвы. питательных веществ и/или путем повышения доступности питательных веществ для растений и/или путем расширения доступа растений к питательным веществам. Следует отметить, что это определение отличает биооплодотворение от биологического контроля.
В то время как упор на биооплодотворение делается на воздействие полезных для растений микроорганизмов, которые улучшают рост растений, устойчивость к стрессу и качество, агенты биоконтроля частично или полностью уменьшают/подавляют патогены растений за счет производства метаболически ингибирующих веществ или, косвенно, за счет повышения естественной устойчивости растения. Оба термина не являются специфическими и не делают различий между бактериями, грибами и другими организмами, которые обладают способностью стимулировать рост растений или биологическим контролем.
Следует отметить многофункциональные свойства микроорганизмов, которые могут одновременно оказывать стимулирующую рост растений и биоконтрольную активность. Как с научной, так и с практической точки зрения производство и широкое внедрение биоудобрений сталкиваются с рядом узких мест, которые необходимо устранить, чтобы полностью реализовать их потенциальные выгоды.
В последние годы, после длительного периода выделения, отбора и характеристики растительно-полезных микроорганизмов, основные направления исследований были ориентированы на оптимизацию процессов ферментации для производства высококачественных и больших объемов биомассы/спор и их дальнейшая рецептура.
Также важно изучить и проанализировать всю биотехнологическую цепочку производства удобрений/биоконтроля, поскольку все ее части взаимозависимы. Это особенно верно для рецептур ферментации и даже процессов и процедур применения при хранении.
Выявление проблем
Производство и широкое внедрение биоудобрений сталкиваются с рядом узких мест, которые необходимо устранить, чтобы полностью реализовать их потенциальные выгоды. Одними из основных задач на уровне производства являются расширение лабораторных технологий, себестоимость продукции и контроль качества. По сравнению с химическими удобрениями, биоудобрения нуждаются в специальном оборудовании, отборных, дешевых и доступных субстратах, а также в контролируемых, оптимизированных условиях для роста микробов.
Кроме того, расширение процесса должно поддерживать жизнеспособность и безопасность выбранного микроорганизма и его эффективность, избегая при этом загрязнения и изменчивости штамма, принимая во внимание двойную природу (оппортунистическую патогенность) большинства почвенных микроорганизмов.
Необходимы дополнительные исследования для выявления и разработки микробных штаммов, которые стабильно и эффективно взаимодействуют с системами растение/почва, а также оптимизируют их производство и рецептуру.
Два производственных процесса
Что мы знаем, так это то, что производственный процесс может осуществляться в твердотельных или погруженных условиях. Многие исследовательские группы работают только над одним из таких вариантов производства.
Однако для биотехнологических компаний, производящих полезные для растений микроорганизмы, было бы очень полезно иметь возможность выбора способа производства. Следовательно, если штамм способен расти и развивать достаточное количество биомассы/спор в твердотельных и подводных условиях, было бы лучше предложить две схемы производства.
Оба процесса обладают конкретными преимуществами и недостатками, которые в целом хорошо известны, хотя они производят разные биопродукты на разных средах и используют разные микроорганизмы. Твердотельная ферментация и погружная жидкая ферментация по-разному влияют на рост микробов и метаболическую активность микробов, и – в некоторых случаях – контроль и управление общим развитием микробов в обоих процессах зависят от окружающей среды.
Например, в проекте H2020 EXCALIBUR (грант номер 817946) мы обнаружили, что простая буферизация среды увеличивает рост Paenibacillus polymyxa в условиях жидкопогружной ферментации (неопубликованные результаты). Однако тот же штамм показал более высокое образование спор в твердом состоянии по сравнению с образованием спор при погружной ферментации, при этом количество КОЕ/мл всегда зависело от типа твердого субстрата.
Наш опыт подтвердил результаты других авторов, а именно, что твердотельная ферментация выгодна по сравнению с погружным процессом. Он предлагает более простой конечный состав в сочетании с жизнеспособностью продукта после более длительных периодов хранения.
С другой стороны, ферментацию под водой легче контролировать, и она может быстрее производить желаемую биомассу и/или полезные для растений микробные метаболиты. Процессы перемешивания на жидкой и средней основе обеспечивают множество преимуществ по сравнению с ферментацией на твердой основе субстрата.
Одним из основных преимуществ является однородное распределение питательных веществ и кислорода в биореакторе. В биопроцессе с возбуждением жидкостью легче манипулировать условиями окружающей среды с последующими соответствующими изменениями микробного поведения. В области микробного производства по-прежнему существует множество неиспользованных биотехнологических схем. Например, периодический режим ферментации с подпиткой, который используется в некоторых биотехнологических мелко- и крупномасштабных процессах, не тестировался при производстве многих биоудобрений и микроорганизмов биоконтроля.
Аналогичным образом, в этой области не применяются процессы с иммобилизованными клетками, рециркуляцией биомассы и непрерывной ферментацией, хотя они предлагают ряд технологических и экономических преимуществ. Здесь следует упомянуть тот факт, что микробные живые клетки обычно прикрепляются к поверхностям или иммобилизуются внутри частиц почвы, и некоторые из вышеперечисленных процессов могут зависеть от этих свойств клеток.
Ферментация и коммерческие возможности
Способ ферментации в значительной степени определяет способ приготовления и тип товарного продукта. Конечные продукты твердотельного брожения состоят из
- Твердые, частично разложившиеся частицы, обычно лигноцеллюлозные отходы, которые во многих случаях одновременно служат носителем и подложкой.
- Микробная биомасса (включая споры) в виде более или менее хорошо развитого слоя мицелия или бактериальных клеток внутри пор субстрата и/или на их поверхности.
- Метаболиты образуются в процессе ферментации с растительно-полезными свойствами.
После сушки и измельчения этот материал можно было использовать непосредственно в качестве коммерческого продукта. Другая возможность заключается в разделении спор материала для дображивания и после смешивания с твердыми защитными средствами, повышающими жизнеспособность клеток, может быть использована в системах почва-растение. Третий вариант — извлечение метаболитной части смеси и образование бесклеточного продукта. Хотя первые два варианта хорошо известны, третий все еще находится в зачаточном состоянии.
Однако мы считаем, что разработка бесклеточных микробных составов на основе полезных для растений метаболитов является будущим биологического сельского хозяйства по многим причинам.
Главный из них — отсутствие необходимости в составе на основе клеток или спор для дальнейшей адаптации и развития в системе почва-растение. Ферментационная жидкость, свободная от клеток, содержит множество метаболитов, некоторые из которых могут стимулировать рост и активность других микроорганизмов в почве или биореакторах.
Обмен метаболитами и специфическими веществами для роста — это естественный процесс внутри данного микробного сообщества в очень сложной среде, такой как почва, которая содержит миллионы микроорганизмов в небольших объемах. Этот процесс также влияет на такие явления, как ощущение кворума, образование биопленок и взаимодействие между растениями и полезными (или патогенными) автохтонными/интродуцированными микроорганизмами.
Следовательно, введение содержащей метаболит бесклеточной жидкости для постферментации также может оказаться непростой задачей и требует дополнительных исследований.
Формулы на основе геля
Другой весьма привлекательной методикой для рецептуры является макро — и микроинкапсуляция клеток и спор фито — или микробных микроорганизмов, в частности, составов на основе двойного, тройного и множественного микробного геля, которые также могут включать фито — или микробные стимуляторы.
В целом, биологические системы, захваченные гелем, предлагают множество преимуществ, таких как лучшее выживание во время хранения и медленное высвобождение их содержимого в почву, одновременно защищая ее от суровых почвенных условий. Кроме того, преимущество состоит в том, что их также можно использовать в процессах ферментации для производства вышеупомянутых метаболитов или минеральных удобрений, если мы можем использовать микроорганизмы, которые растворяют нерастворимые минеральные материалы.
Важной особенностью растительно-полезных микроорганизмов является их абиотическая и биотическая способность бороться со стрессом. Это еще один сложный вопрос, который зависит от способа производства и рецептуры микробов в системах почва-растение. Анализируя результаты, полученные нами в рамках этого направления многонационального проекта EXCALIBUR, выяснилось, что микроорганизмы чувствуют себя лучше и более эффективны в иммобилизованном состоянии.
Понимание и оценка воздействия
Следует лучше учитывать влияние микробных формулировок на подземное биологическое разнообразие и функции.
Фактически, даже несмотря на то, что ряд продуктов на основе микробов коммерчески доступен во всем мире, проблема содействия широкому применению продуктов на основе микробов связана с тем фактом, что их полезные свойства не всегда последовательно выражаются в условиях полевого культивирования. Взаимодействия между растениями и полезными микроорганизмами сложны, и механизмы, регулирующие систему растение-почва-микроорганизмы, еще предстоит открыть.
Это особенно актуально при сравнении результатов экспериментов, которые проводятся in vitro в лаборатории и in situ в тепличных и сложных сельскохозяйственных условиях. Механизмы, лежащие в основе судьбы и устойчивости биоинокулянтов в почве, могут быть результатом суммы множества переменных и, следовательно, их трудно понять и предсказать.
Биоинокуляты, попадающие в почву, часто приводят к временным нагрузкам микробных штаммов, которые обычно со временем исчезают. Таким образом, логично предположить, что сохраняющиеся микробные инокулянты будут оказывать более длительное воздействие, чем короткоживущие инокулянты. Учитывая предполагаемое временное выживание биоинокулятов, многие ученые и практики предполагают, что почвенные микробные инокулянты окажут незначительное воздействие на автохтонные почвенные микробные сообщества.
Однако быстрое исчезновение инокулята в почве не обязательно означает отсутствие длительных изменений в сообществе почвенных жителей. Например, инокуляция Rhizobium для повышения продуктивности сои существенно повлияла на бактериальное сообщество в ризосфере сельскохозяйственных культур и грибковое сообщество.
Кроме того, внедрение непатогенной Escherichia coli в почву изменило структуру ниш местных бактериальных сообществ, что привело к изменениям относительной численности значительных родов почвенных бактерий, таких как Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia и Bradyrhizobium.
Выживаемость микробных инокулянтов в почве зависит и от нативной микробиоты почвы: Она высока, когда разнообразие автохтонного микробного сообщества низкое и наоборот.
Однако следует иметь в виду важность оценки воздействия прививки во временном контексте, поскольку последствия могут меняться с течением времени. Например, в большинстве исследований, посвященных влиянию микробных инокулянтов на местные сообщества почвы, эффекты измерялись только в течение короткого периода после инокуляции, обычно в течение вегетативного сезона.
В большинстве случаев прививка привела к изменениям в структуре местных сообществ, но остается неясным, может ли воздействие сохраняться в течение более длительного времени, что указывает на фактическую способность к устойчивости после беспорядков.
Будущий прогноз
Из-за важности микробиома основные механизмы связи и взаимодействия между микробиомами и окружающей средой требуют лучших знаний, что должно расширить нашу нынешнюю целостную концепцию, признавая, что биотические (растения и животные) и экологические (почва, вода и воздух) микробиомы образуют интерактивную сеть, которая может влиять на сборку и функции голобионтов всех живых организмов в экосистеме.
Подходы к ферментации и рецептуре, в которых используются методы совместного культивирования, использование отходов в качестве субстратов и синергические взаимодействия между штаммами, представляют собой перспективную стратегию стимулирования коммерческого производства микробных консорциумов, которые могут преодолевать стрессы окружающей среды по сравнению с отдельными штаммами, тем самым обеспечивая более низкий риск сбои в полевых условиях.
Более того, потенциальная многофункциональность многих полезных штаммов может представлять собой дополнительную возможность для разработки инновационных продуктов на основе микробов, хотя вопросы регулирования могут контрастировать с их коммерческим применением.
Участники
Николай Василев
Кафедра химического машиностроения
Университет Гранады (Испания)
Мария Василева
Кафедра химического машиностроения
Университет Гранады (Испания)
Доктор Стефано Мокали, доктор философии
Исследователь
Координатор проекта ЭКСКАЛИБУР
CREA-AA, Флоренция (Италия)
https://www.crea.gov.it/en/web/agricoltura-e-ambiente/
