В журнале Plant Methods опубликован обзор, авторы которого предлагают пересмотреть методы изучения взаимодействий между белками в клетках растений. От этих взаимодействий, образующих сложную сеть, зависят все жизненные процессы – от иммунных реакций до поиска воды корнями. По мнению исследователей, существующие карты этой сети неточны и изобилуют ошибками из-за несовершенства аналитических инструментов. Новый трехступенчатый подход должен решить эту проблему и дать более достоверную картину молекулярных процессов.
Ключевая сложность в том, что белковые взаимодействия в растениях динамичны: они часто слабые, кратковременные и происходят в строго определенных частях клетки. Традиционные методы, такие как анализ в пробирке или система дрожжевого двугибридного скрининга, проходят в искусственных условиях. Они не воспроизводят специфическую среду растительной клетки, что приводит к появлению как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Методы, которые анализируют белковые комплексы непосредственно из тканей растений, тоже имеют недостаток: на этапе разрушения клеточных стенок рвутся как раз те слабые связи, которые и представляют наибольший интерес для ученых.
Основу нового подхода составляет технология биотинилирования по принципу соседства, в частности метод TurboID. Специальный фермент, прикрепленный к исследуемому белку, помечает биотиновой меткой все соседние белки в радиусе около 10 нанометров. Важно, что это происходит в живой, неповрежденной клетке. Таким образом, информация о «соседях» сохраняется, даже если сами связи между белками разрушатся при последующей обработке образца. Технология TurboID адаптирована для растений – она позволяет проводить мечение всего за десять минут при комнатной температуре.
Поскольку TurboID определяет только соседство белков, а не их прямое взаимодействие, полученный список кандидатов нужно проверять. Для этого авторы обзора предлагают двухэтапную фильтрацию. Сначала потенциальные пары проверяют с помощью метода комплементации разделенной люциферазы (NanoLuc), который по световому сигналу подтверждает физический контакт белков в живой клетке. Наиболее перспективные взаимодействия затем анализируют с помощью флуоресцентной микроскопии (FRET–FLIM) – «золотого стандарта» в этой области. Этот метод дает количественную оценку связи на наноуровне и доказывает, что она существует в естественных физиологических условиях.
Комплексный подход, сочетающий широкомасштабный поиск, проверку и количественное подтверждение, позволит создать первую достоверную карту белковых взаимодействий у растений. Понимание этих сетей напрямую влияет на продовольственную безопасность. Оно открывает возможности для целенаправленного изменения ключевых белков, чтобы создавать сорта сельскохозяйственных культур, более устойчивые к болезням, засухе и другим неблагоприятным факторам.